E' la prima opera eseguita per una destinazione pubblica: è il primo dipinto visto da tutta la popolazione della città di Roma e soprattutto dai pittori suoi colleghi e concorrenti.
Per accentuare la tensione drammatica dell'immagine e focalizzare sul gruppo dei protagonisti l'attenzione di chi guarda, ricorre all'espediente di immergere la scena in una fitta penombra tagliata da squarci di luce bianca.
La tela è densa di significati allegorici. In primo luogo proprio la luce, grande protagonista della raffigurazione pittorica, è simbolo della Grazia divina (non a caso non proviene dalla finestra dipinta in alto a destra che, anzi, resta del tutto priva di luminosità, ma dalle spalle di Cristo), Grazia che investe tutti gli uomini pur lasciandoli liberi di aderire o meno al Mistero della Rivelazione.
La luce inoltre ha la funzione di dare direzione di lettura alla scena, che va da destra a sinistra e torna indietro quando incontra l'umanissima espressione sbigottita ed il gesto di San Matteo che punta il dito contro se stesso al fine di ricevere una conferma, come se chiedesse a Cristo e a San Pietro: "State chiamando proprio me?".
Di grande intensità e valenza simbolica è il dialogo dei gesti che si svolge tra Cristo, Pietro e Matteo.
Il gesto di Cristo (che altro non è che l'immagine speculare della mano protesa nella famosissima scena della Creazione di Adamo della Cappella Sistina michelangiolesca, che Caravaggio avrà certo avuto modo di studiare ed apprezzare) viene ripetuto da Pietro e a sua volta ripetuto da Matteo.
Grazie alla radiografia, sappiamo che nella prima versione, non era presente la figura di San Pietro, aggiunta successivamente.
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